• 手机网站
     

    betway官网 KNOWLEDGE

    betway官网_betway客户端下载_betway88必威

    地址:上海市浦东新区行南路1288号2号门
    电话:021-50122360/18918588703
    邮编:200137
    邮箱:info@nanjue.net

    betway官网
    您现在的位置:首页 >> 石蜡切片制作标准程序
    动物病理组织学
    石蜡切片制作标准操作程序(SOP)
    一、器材和试剂准备
    (一)载玻片和盖玻片的清洁
    1.载玻片和盖玻片清洗方法
    (1)锅内倒入适量清洗液(100 mL水+30 m L洗洁精+30 mL 84消毒液); 
    (2)将玻片逐片放入锅中, 加热至沸腾10 min, 停止加热, 自然冷却; 
    (3)捞出玻片流水冲洗10min,彻底冲净泡沫(弹簧夹上后,单片过水); 
    (4)将玻片从水中取出, 用蒸馏水冲洗三遍(最好单片过水); 
    (5)将玻片放入 95%乙醇(分析纯)中浸泡;
    (6)取出玻片,码在切片盒,自然干燥(或无风适度高温干燥)备用;
    注意:由于盖玻片很薄,不能同载玻片放在一起处理;盖玻片从95%乙醇溶液中取出后要放在吸水纸上摊开,干燥后,放在小盒子中备用。
     
    2.粘片剂(蛋白甘油)的制作及载玻片的预处理
    (1)蛋白甘油的制作  取新鲜鸡蛋,先将其尖端用眼科剪或拨针挑破一小孔,再将蛋的另一端挑破一小孔并稍加扩大,大孔端朝下,使蛋白流入100~200毫升的烧杯中(不要蛋黄),以玻棒打拌蛋白完全变为雪花状泡沫,然后倒入垫有几层纱布的漏斗中过滤而得到透明、清凉的的蛋白液,再加入等量甘油,振摇使之充分混合,加入1%麝香草酚或樟脑防腐。一般将其盛入滴瓶或树胶瓶中备用,不用时盖好防尘。
    或1个鸡蛋的蛋清+500mL双蒸馏水,混匀,加10mL浓氨水。
    (2)将蛋白甘油倒在小烧杯中,载玻片用弹簧夹夹上后侵入蛋白甘油中,贴壁刮干,放在切片盒内晾干备用。
     
    二、石蜡组织切片的制作
    (一)取材
    注意事项:
    1.材料质量:材料必须新鲜,应争取在死后半小时内处理完毕。
    2.取材体积:组织块力求小而薄(厚度不要超过5mm,以2mm最佳)
    3.取材力度:取材器具锋利。勿使组织块受挤压,切割时不可来回挫动。夹取组织时,切勿猛压,以免挤压损伤组织。取材时,组织块可稍大一点,以便在固定后,将组织块的不平整部分修去。    
    4.固定形状:固定尽量保持组织的原有形态  新鲜组织经固定后,或多或少会产生收缩现象,有时甚至完全变形。为此可将组织展平,以尽可能雅持原形。对神经、肌肉、皮肤组织等,则可将其两端用线扎在木片上或硬纸片上固定。
    5.切向选择:选好组织块的切面应熟悉器官组织的结构并据此决定其切面的走向。纵切或横切根据观察目的而定。     
    6.材料冲洗:保持材料的清洁组织块上如有血液、污物、粘液、食物、粪便等,先用生理盐水冲洗,然后再入固定液。
    7.组织清除:切除(清除)不需要的部分  特别是组织周围的脂肪等,应尽可能清除掉,以免影响以后的程序和观察。
    (二)固定
    1.固定液体积为固定组织的20倍为宜,在固定的初期,注意间断性的轻轻摇动。
    2.固定时间,至少24h。
    3.对肺组织
    附件:双固定液即多聚甲醛—戊二醛混合固定液:(光镜和电镜均可)
     
    (I) 0.2M (mol/L),pH=7.4 PB(磷酸盐缓冲液)
    每1升0.2M PB中含
    NaH2PO4•2H2O (Mr= 156) …………………………… 3g 
    Na2HPO4•12H2O(Mr=358 ) ………………………… 29g 
     先加1种盐溶解后再加入另一种。如果要求较高,可以灭菌。
     
    (II)10%多聚甲醛溶液的配制
    多聚甲醛10 g,加入100mL去离子水中,加1N氢氧化钠溶液5滴,水浴锅加热到70℃,边震荡边加入1N氢氧化钠溶液直至溶液澄清(约需5滴),冷却备用。
    1N(=1mol/L)氢氧化钠溶液:4g氢氧化钠,溶于100mL去离子水,用硬质塑料广口试剂瓶装。
     
    (III)2.5%戊二醛+2%多聚甲醛混合固定液  1L
    10%多聚甲醛    200mL   
    25%戊二醛      100mL   (如果为50%戊二醛时,用50mL)
    0.2M PB        500mL   
    去离子水       补致  1000mL
     
     
    (三)修快和洗涤
    1.修块之前(或之后),需要用自来水对组织块进行洗涤。最好将块修好后,标记好,放在密闭的镂空铁盒中微流水冲洗。一般新固定的组织冲洗6-8h,长期固定的组织24-48h。
    2.修快厚度2-3mmX15mmX15mm。修块的目的是为了,后面的包埋,特别要注意切向和切面问题,切面要平整,以方便在包埋时能立在纸盒中。一定要至少保留将来的切片中至少能见到有一面为组织器官的被摸面,其他面如需要修整,最好取直角,方便展片。
    (四)脱水
    程序:50%酒精(1h)→70%酒精(1h或过夜)→80%酒精(1h)→95%酒精I(0.5-1h)→95%酒精II(0.5h)→纯酒I(30min) →纯酒I(20min) 
    注意:(1)高于80%的酒精不能时间过长,否则组织易脆。
    (五)透明
    程序:纯酒-二甲苯(1:1)(20min)→二甲苯I(10-20min) →二甲苯II(10-20min)
    注意:透明时间一般取短(10min),以组织块刚透明为宜。
    (六)浸蜡
    程序:石蜡(52-58℃)I(30min)→石蜡(52-58℃)II(30min)→石蜡(52-58℃)III(30min)
    注意:(1)温箱温度一般高于蜡的熔点5℃,设定在65-70℃。(2)蜡必须提前加热融化后,放入温箱内保温平衡2-4h。(3)尽量将透明的二甲苯控净。
    (七)包埋
    1.切面向下,每个蜡块可以包2-4个组织,每个纸盒可以包多个蜡块。
    2.先将热包埋蜡(可以加适当比例蜂蜡)倒入纸盒内,用小镊子摆好组织块,全过程有电热吹风机吹热分,以保证蜡处于融化态。
    3.迅速冷却,等表面凝固后轻轻将蜡盒转移到冷水,加速凝固。
    (八)切片、展片和烤片
    1.修块:修成正方形、长方形或梯形,受刀面一定要平行,组织周围留约2 mm的石蜡边。
    2.粘块:有时要将蜡块牢固地粘到小木块上,注意切面和受刀面平直。如果气温高粘好块后,可以放在4℃冰箱里,先预冷。
    3.刀要锋利,刀口要与切面(约25度角)和受刀面平行。先20-50微米的粗切修面,然后调到5微米。为连成带状,需要哈气,增加水汽表面张力,使切片展开。毛笔转入干净硬纸上。
    4.水浴40℃左右。先用拨针将蜡片分开,光面贴水,在水浴中展开后拨去多余的蜡。
    5.用载玻片(注意标记和记录)捞取组织,并调节到最佳位置。一张载波片上可以放1-3块蜡片。将玻片水平放在玻片板上,放在空气中或37℃烘箱内晾干。
    6.烤片:60℃烤箱,30-60min烤片。烤好的切片就可以进行下面的染色。
    (十)染色
    将烤好的切片,用弹簧夹夹好,(注意有组织面方向要朝向一面,边上的一块保证组织面向里。
    常规石蜡切片HE染色程序简介
    注意:二甲苯脱蜡和酒精脱水时,如果温度低可以考虑延长时间。

    Copyright © 2015  betway官网_betway客户端下载_betway88必威  页面版权所有   沪ICP备09014486号    betway必威手机版官网